过程很麻烦，不是熟手，最好叫人替做。

过程很麻烦，不是熟手，最好叫人替做。

谢谢！！但你 能帮我指点一下大概的步骤吗？其中每步骤的注意事项，好吗？非常感谢！！我是不是很贪呀！哈哈！！

哈哈,老兄，巧了,本人做过FISH。现将自己的一些感受说出来与大家分享，不对的地方请大家指正。FISH的特点：操作烦琐，步骤简单。说它操作烦琐，是因为它的操作步骤烦多，每一步又需要相当长的时间，如果自己标探针的话每批标本大约三天时间（买试剂盒只需一天，但价格昂贵），你说是不是很烦琐？说它步骤简单也是有道理的。FISH其实并没什么神秘之处，只要操作过程仔细，严格按照操作步骤操作，很容易做成功，比PCR要简单得多，所以说它是步骤简单。但FISH有一些关键步骤是必需注意的，现就本人的理解说出来与大家分享。（1）探针的设计。设计探针要根据实验的需要来进行，也就是说你要检测的目的基因决定你的探针设计，如上面老兄说的“目的基因大概是1.8KB，所转材料是大豆”，我想你可以直接对你的PCR产物进行地高辛或生物素标记，如果探针较大，则可购买BAC或YAC等克隆进行探针标记。（2）标本的预处理。标本的处理也关系到最后信号强弱的一个关键，但有些人不注意这些细节，结果造成荧光信号弱，难以分辨。这与预处理不当造成探针难以到达胞核而杂交难以进行有关。（3）变性。这一步是FISH关键中的关键。变性包括标本变性和探针变性，这两个步骤关系到FISH的成败，千万要严格按照操作规程进行，不但如此，特殊标本还要自己摸条件。试想变性不彻底，DNA的双链都没能完全打开，杂交能顺利进行吗？需要注意的就以上这三点，还要唠叨一句：操作荧光抗体时千万要避光，否则将前功尽弃。哈哈，就说这几点体会，大家有什么意见请与我联系。本人邮箱：dmt960322@yahoo.com.cn

原位杂交程序（地高辛）1、制片2、胃蛋白酶(500ug/ml) 1：75 with HCL 0.01MSlidesPepis(ul)HCL 0.01mol(ul)Final volume(ul)410.7789.3800821.31578.71600150ul/ Slides37℃ 20min 2×SSC7min on the shaker3、RNAase(10mg/ml) diluted 1:100 with 2×SSC 150ul/ Slides 37℃ 1h2×SSC5min×3on the shaker4、固定脱水4％多聚甲醛10min2×SSC5min×3on the shaker 70%乙醇3min on the shaker100％乙醇3min on the shaker空气干燥5、杂交配制杂交混合液：单色：1 slide 4 slides甲酰胺100％2510020×SSC520鲑鱼精DNA0.52Probe520SDS%2.510Blocking28硫酸葡聚糖50%1040Total50200注：探针未纯化Mixture70℃ 10min 变性 立即放在冰上，静置10min80℃5min 共变性37℃ 过夜6、检测 20％ 甲酰胺（0.1×SSC）42℃ 10min42℃ 2×SSC 5min×2 室温2×SSC 5min×2 on the shaker4×SSC 5min×2 on the shaker 5%BSA with 4×SSC/Tween 205min 1:75 anti-DIG FITC with5%BSA with 4×SSC/Tween 2037℃1h 4×SSC/Tween 20 5min×3 on the shaker7、扩增100 ul 5%兔血清/片 5min 2.5ul anti-sheep-FITC with 5%兔血清/片 37℃ 1h 4×SSC/Tween 20 5min×3 on the shaker8、复染封片 DAPI(2ug/ml) 100ul/slide盖片，室温15min 揭片1×PBS抗焠灭剂 1滴原位杂交程序（生物素）1、制片2、胃蛋白酶(500ug/ml) 1：75 with HCL 0.01MSlidesPepis(ul)HCL 0.01mol(ul)Final volume(ul)410.7789.3800821.31578.71600150ul/ Slides37℃ 20min 2×SSC7min on the shaker3、RNAase(10mg/ml) diluted 1:100 with 2×SSC 150ul/ Slides 37℃ 1h2×SSC5min×3on the shaker4、固定脱水4％多聚甲醛10min2×SSC5min×3on the shaker 70%乙醇3min on the shaker100％乙醇3min on the shaker空气干燥5、杂交配制杂交混合液：单色：1 slide 4 slides甲酰胺100％2510020×SSC520鲑鱼精DNA0.52Probe520SDS%2.510Blocking28硫酸葡聚糖50%1040Total50200注：探针未纯化Mixture70℃ 10min 变性 立即放在冰上，静置10min80℃5min 共变性37℃ 过夜6、检测 20％ 甲酰胺（0.1×SSC）42℃ 10min42℃ 2×SSC 5min×2 室温2×SSC 5min×2 on the shaker1×PBS 5min×2 on the shaker 5%BSA with 1×PBS5min 1:40 Cy3 37℃30min 1×PBS 5min×3 on the shaker7、复染封片 DAPI(2ug/ml) 100ul/slide盖片，室温15min 揭片1×PBS抗焠灭剂 1滴原位杂交程序（双色）1、制片2、胃蛋白酶(500ug/ml) 1：75 with HCL 0.01MSlidesPepis(ul)HCL 0.01mol(ul)Final volume(ul)410.7789.3800821.31578.71600150ul/ Slides37℃ 20min 2×SSC7min on the shaker3、RNAase(10mg/ml) diluted 1:100 with 2×SSC 150ul/ Slides 37℃ 1h2×SSC5min×3on the shaker4、固定脱水4％多聚甲醛10min2×SSC5min×3on the shaker 70%乙醇3min on the shaker100％乙醇3min on the shaker空气干燥5、杂交配制杂交混合液：甲酰胺100％2510020×SSC520鲑鱼精 DNA0.52SDS%2.510硫酸葡聚糖50%1040Total53212注：探针未纯化Mixture70℃ 10min 变性 立即放在冰上，静置10min80℃5min 共变性37℃ 过夜6、杂交后洗脱 20％ 甲酰胺（0.1×SSC）42℃ 10min42℃ 2×SSC 5min×2 室温2×SSC 5min×2 on the shaker4×SSC 5min×2 on the shaker 5%BSA with 4×SSC/Tween 205min 7、检测 DIG1:75 anti-DIG FITC with5%BSA with 4×SSC/Tween 2037℃1h4×SSC/Tween 20 5min×3 on the shaker8、扩增100 ul 5%兔血清/片 5min 2.5ul anti-sheep-FITC with 5%兔血清/片 37℃ 1h 4×SSC/Tween 20 5min×3 on the shaker9、检测 生物素1×PBS5min×2 on the shaker 5%BSA with 1×PBS5min 1:40 Cy3 37℃ 30min 1×PBS 5min×3 on the shaker10、复染封片 DAPI(2ug/ml) 100ul/slide盖片，室温15min 揭片1×PBS抗焠灭剂 1滴原位杂交程序（地高辛）.doc(27.5k)

生物素的原位杂交程序（生物素）.doc(27.0k)

双色的原位杂交程序（双色）.doc(28.0k)

顶，前辈。有双色探针标记的试剂盒吗？？

日本常光的试剂盒不错，我们实验室最近在试用，不过只针对HER2只一个分型的